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Ratto geneticamente modificato (GM)

Gli animali da laboratorio vengono usati da lungo tempo nella ricerca medica come strumenti per dimostrare i processi patologici o genetici che sono alla base di molte malattie umane e in esse implicati. In realtà, l'umile ratto da laboratorio era già stato usato per questo scopo dalla metà del XIX secolo e agli inizi del XX secolo Henry Donaldson all'Wistar Institute di Philadelphia sviluppava i primi ceppi di ratti endogamici. Questa prima colonia, allevata per la ricerca nel campo della genetica, delle neuroscienze e del cancroANCHOR, segnò l'inizio di una relazione iniziata un secolo fa, e che continua tuttora, tra scienziato e roditore. I vantaggi derivati da questa avventura degli ultimi 100 anni, si sono rivelati di valore inestimabile per molte aree della medicina, dai modelli di malattie cardiovascolariANCHOR, ai trapiantiANCHOR, depressioneANCHOR, e più di recente le potenzialità di una terapia cellulare per ripristinare la funzione del corpo a seguito di lesione del midollo spinale.ANCHOR ANCHOR

Storia della tecnologia transgenica

La tecnologia transgenica permette al gene in questione di essere introdotto nel genoma di un animale da laboratorio; essa è uno strumento straordinariamente potente per l'abbattimento dei sostegni molecolari della malattia. La tecnologia transgenica fu sviluppata nei topi durante gli anni '80, inizialmente per tacitare un gene esistente (modelli knockout). Successivamente fu sviluppata la tecnologia per introdurre un nuovo gene, o per ottenere l'espressione di un gene a livelli più alti del normale (modelli knockin), e per ottenere l'espressione di un gene in un tessuto specifico e / o in un momento specifico (modelli transgenici condizionali)ANCHOR. Nei topi ciò comporta l'impiego di cellule embrionali staminali (ES). Queste cellule sono estratte dalla parte interna di un embrione ai primi stadiANCHOR, e sono catratterizzate da tre proprietà specifiche: i) capacità di rinnovarsi all'infinito, e il potenziale di svilupparsi in qualsiasi cellula nel corpo (pluripotenza) ii) capacità di essere incorporato in un organismo iii) capacità di svilupparsi in gameti da trasmettere alla proleANCHOR. Nei topi, le cellule embrionali staminali (ES) sono isolate e mantenute in una linea cellulare, dove il DNA può essere alterato aggiungendo, sottraendo o modificando il materiale genetico con relativa facilità. Queste cellule possono essere reintrodotte nell'embrione, nel quale danno origine a molte cellule del corpo. Se danno origine ai gameti, quando questi animali si riproducono partoriranno della prole eterozigotica, che è quella che ha una copia del gene introdotto. Se due eterozigoti si accoppiano, daranno origine ad una prole con due copie del gene introdotto (omozigote). I modelli di topo transgenico si rivelano sempre più utili, specialmente per i disturbi genetici, come distrofia muscolare Duchenne e fibrosi cistica, e adesso sono usati per studiare una vasta gamma di malattie. In realtà, in una valutazione dell'efficacia dei modelli animali per i 100 farmaci più venduti, Zambrowics e SandsANCHOR affermano che 2Una valutazione restrospettiva….indica che questi fenotipi sono ben correlati alla nota efficacia del farmaco, illuminando un percorso produttivo per la scoperta di futuri farmaci a bersaglio"

Ratti transgenici?

Se da un lato ciò appare entusiasmante e promettente per la comunità scientifica, dall'atro ci sono degli incovenienti: è noto che le similarità fisiologiche che i topi hanno con l'uomo, sono meno rispetto a quelle che hanno i ratti, perciò i topi risultano meno appetibili come modelli di malattie umane.ANCHOR Dal punto di vista comportamentale, i ratti sono simili all'uomo per capacità di apprendere e portare a termine diverse attività sperimentali. Inoltre, date le loro dimensioni, eseguire procedure chirurgiche e monitorare gli stati fisiologici, è molto più facile nei ratti che nei topiANCHOR. Tuttavia, fino a poco tempo fa, i tentativi di isolare le cellule ES nei ratti sono stati vani. Nei topi, le cellule ES hanno conservato il loro pluripotente stato nel siero bovino e nelle cosiddette 'cellule feeder' che rilasciano una sostanza chimica nota come Fattore inibitore della leucemia (Leukemia Inhibitory Factor, LIF)ANCHOR, ma questo metodo è fallito nei rattiANCHOR. Negli animali, come pecore e maiali, il problema è stato superato impiegando le tecniche di clonazioneANCHOR, ma di nuovo, si è rivelato difficile applicare le stesse tecniche nel ratto. Le cellule sono risultate molto instabili, e ogni minimo disturbo le attivava, di conseguenza non è stato possibile impiantarle in un embrione e portarlo a termine.

Svantaggi

Ciò non equivale a dire che i ratti transgenici non sono mai stati impiegati nella sperimentazione, piuttosto che il loro utilizzo ha implicato altre tecniche che non sono ideali ai fini della sperimentazione. Tutte queste tecniche presentano degli svantaggi di fondo.
 
 
Per esempio, un metodo comune usato è quello di introdurre le mutazioni a caso nelle cellule, sia usando la sostanza chimica ENUANCHOR, oppure i retrotrasposoniANCHOR, che sono degli elementi genetici mobili che si inseriscono a caso nei geni, creando disturbando la loro attività. Il problema dell'utilizzo di una o dell'altra tecnica è rappresentato dal fatto che le mutazioni risultano a caso. Lo scienziato ha bisogno di mutare un vasto numero di animali ed esaminare i fenotipi che ne scaturiscono, per poi eseguire le analisi genetiche e controllare se un cambiamento di comportamento sia dovuto a una mutazione del gene desiderato. Questa è ovviamente una procedura costosa.

Una tattica diversa è quella di prendere un gene che interessa e inserirlo nel nucleo di un embrione a cellula singola mediante iniezione direttaANCHOR, o utilizzando un lentivirus in modo che il gene infetti la cellulaANCHOR. Questo metodo può essere impiegato solo per introdurre quantità piccole di materiale genetico, fino a un massimo di circa 10kb di lunghezza che non è abbastanza per contenere la maggior parte dei geni. Il materiale genetico inserito è soggetto a 'effetti di posizione', in altre termini, sarà inserito nel genoma in una posizione casuale, perciò condizionerà, e sarà condizionato dal materiale genetico attorno ad esso.

Questi problemi possono essere superati impiegando dei cromosomi artificiali (come batteri, lieviti), poichè essi consentono di inserire una quantità molto maggiore di informazioni genetiche e possono includere una regione 'cuscinetto' ANCHOR attorno al gene di interesse per proteggere lo stesso dagli effetti eventuali della sua posizione. Purtroppo questo metodo è molto meno efficiente e impone la creazione di molte linee di animali transgenici spesso prima che esso dia risultati di successo. Questi problemi hanno fatto sì, finora, che i ratti transgenici incidessero molto limitatamente sulla ricerca biomedica.

Successi recenti

Alla fine del 2008, sono stati pubblicati due interessanti studi nella rivista Cell che promettevano di cambiare radicalmente questa situazione. Due gruppi, operando separatamente, hanno messo a punto delle tecniche simili per isolare e mantenere le cellule embrionali staminali pluripotenti nei ratti: Il laboratorio del Professor Austin Smith di Cambridge, (Regno Unito) ANCHOR e il laboratorio del Professor Qi-Long Ying della University of Southern CaliforniaANCHOR.

Il siero, che è impiegato nei metodi di isolamento e coltura delle cellule ES dei topi, contiene delle sostanze che spingono le cellule ES del ratto, e in realtà cellule S di alcuni ceppi di topo, verso la differenziazione (committment) perciò i ricercatori lo hanno rimosso dal mezzo di coltura.

Tuttavia, eliminare solo il siero non è sufficiente a mantenere le cellule staminali di ratto, in quanto queste stesse secernono una proteina nota come fattore di crescita dei fibroblasti 4 (fibroblast growth factor 4 FGF4) che anch'essa spinge le cellule staminali a differenziare per mezzo di un sistema di segnalazione cellulare noto come percorso MEK/ERK. La ricerca promettente sui topi, la quale ha dimostrato che l'interruzione di questo percorso permetteva alle cellule staminali di autorinnovarsi, è stata pubblicata nel 2006ANCHOR così entrambi i gruppi di scienziati hanno sfruttato una strategia 'inibitoria 3' (i3) che ha impiegato:

i) una sostanza inibitoria per ridurre l'attività della FGF4

ii) un inibitore del percorso MEK per ostacolare la segnalazione

iii) un inibitore di un'altra sostanza detta glicogeno-sintasi-chinasi 3 (GSK3) che si impiega per inibire la capacità biosintetica della cellula

iv) Fattore inibitore della leucemia (Leukemia Inhibitory Factor, LIF)

Sorprendentemente, entrambi gli studi hanno scoperto che questa tecnica permette di mantenere le cellule embrionali staminali in uno stato di pluripotenza all'infinito. È vero che uno degli studi9 ha incontrato qualche problema (errori sistematici sul sesso e mutazioni), ma una lieve modifica ha reso la procedura solida e affidabile. Si prevedono degli effetti enormi sulla comunità scientifica. Oggi, per la prima volta, le cellule ES si possono usare per creare modelli di ratti transgenici in cui il gene modificato sostituisce direttamente il gene normale, superando i problemi connessi alla tecnologia transgenica del ratto fin qui incontrati. Con l'impiego di questo metodo, la tecnologia transgenica del ratto dovrebbe diventare precisa e potente come è quella dei topi, fornendo migliori modelli di malattie umane. Mentre l'anno cinese del ratto declina, il tempo del ratto da laboratorio matura rapidamente.


References

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  22. Li, P. et al., (2008) Germline competent embryonic stem cells derived from rat blastocysts, Cell, 135(7), 1299-1310.**
  23. Chen, S. et al., (2006) Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule, PNAS, 103(46), 17266-71.**

** Of special interest
* Of some interest


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