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Topo geneticamente modificato (GM)


A seguito della pubblicazione della sequenza e analisi di un ceppo di topo nel dicembre del 2002ANCHOR il topo è diventato il modello animale preferito nella stragrande maggioranza degli esperimenti di laboratorio. Le potenzialità di manipolazione genetica dei topi, stanno a significare che il loro utilizzo oggi spesso si preferisce a quello dei ratti e altri roditori, sia nei test di sicurezza che nella ricerca principale. I topi geneticamente modificati, transgenici e topi knockout, ovvero con un gene soppresso, oggi sono dei validissimi strumenti nella stragrande maggioranza dei campi della ricerca medica.

Il topo è un eccellente modello delle malattie umane in quanto sia l'organizzazione del suo DNA, sia il modo in cui i suoi geni sono espressi, sono molto simili a quelli dell'uomo. Il loro sistema nervoso e quello riproduttivo sono come quelli dell'uomo, contraggono molte delle malattie umane, come cancro, diabete e persino l'ansia. La manipolazione dei loro geni può provocare in loro altre malattie dalle quali normamlmente non sarebbero colpiti; ne consegue che la ricerca sui topi ha contribuito ad una migliore comprensione sia della fisiologia umana che delle cause delle malattie.

Prima della tecnologia genetica, i topi venivano generati per endogamia per creare ceppi di laboratorio con caratteristiche particolari. Questi ceppi endogamici sono geneticamente molto simili, ciò li rende ideali per lo studio dei cambiamenti in seguito alla modificazione genetica.

Statistica
Cos'è un topo transgenico?
La creazione di topi transgenici
Exempi di ceppi transgenici
Topi knock-out
Il retroterra del processo di indivuazione dei geni bersaglio
La creazione di topi knock-out
Esempi di topi knockout
Bibliografia

Statistica

La possibilità di manipolare i suoi geni, ha fatto del topo l'animale da laboratorio più comunemente usato. Nel Regno Unito l'uso dei topi è aumentato negli ultimi 10 anni, con un aumento del 5% riportato fra il 2005 e il 2006. La maggioranza dei topi è stata impiegata in programmi di riproduzione e nella ricerca biologica di base.ANCHOR Il recente aumento del numero di topi impiegati è una diretta conseguenza dello sviluppo di nuove tecnologie che permettono la manipolazione dei loro geni.

Cos'è un topo transgenico?

Un topo transgenico è quel topo i cui cromosomi sono stati alterati con l'introduzione di DNA straniero nei suoi geni. Questi geni si trovano nel nucleo di ogni cellula del corpo, perciò tutte le cellule del topo contengono il nuovo DNA. Il DNA straniero può provenire da qualsiasi parte, può essere DNA umano, di un altro animale o di un altro topo. La modifica del DNA generalmente significa che le cellule acquisiscono una funzione, come il produrre una nuova proteina. Per esempio, alcuni prodotti di topi transgenici contengono delle proteine riconosciute dalle cellule del sistema immunitario umano; queste proteine possono essere usate per modellare aspetti particolari della malattia. Il DNA straniero talvolta più che tradursi nell'acquisizione di una funzione si traduce nella perdita di essa, in quanto il nuovo DNA potrebbe interferire con un percorso biochimico o impedire la produzione di una determinata proteina. I topi transgenici sono degli utili modelli per capire come i geni regolano i processi nell'organismo, in quanto l'effetto che incide su un determinato gene si può vedere nell'intero  organismo. Inoltre sono usati per studiare le malattie dell'uomo, quelle causate da 'errori' nel modo in cui il corpo produce certe proteine, per esempio nell'emofilia A, i codici genetici di cruciale importanza di una proteina nota come fattore VIII, necessaria alla coagulazione del sangue.

La creazione di topi transgenici

Le due principali tecniche di introduzione di DNA straniero nel topo: o mediante un'iniezione di DNA nel pronucleo, oppure mediante l'uso di cellule staminali embrionali.

Con l'iniezione nel pronucleo, il DNA straniero viene iniettato nel pronucleo dell'ovulo del topo che si forma immediatamente dopo esser stato fecondato. Il DNA straniero si integra nel genoma in una posizione a caso, di solito dopo che la prima o le prime due divisioni cellulari hanno avuto luogo. Ciò significa che il DNA transgenico non sarà presente in tutte le cellule del topo, e di conseguenza, esso sarà solo parzialmente transgenico. Gli ovuli o lo sperma di topi transgenici vengono quindi usati per creare la generazione successiva di topi totalmente transgenici.

Quando il DNA viene introdotto nelle cellule staminali embrionali, generalmente si integra nel genoma a caso, ma se dovesse risultare di struttura simile ad una parte esistente del genoma, esso può essere ‘riconosciuto’ dal DNA – in tal caso va incontro a ricombinazione omologa, e una copia singola si integrerà nel genoma in una posizione specifica. Le cellule embrionali, che hanno bisogno di crescere, vengono dunque iniettate in un embrione ospite, andando a far parte dunque del topo che si sviluppa da quell'embrione. Il topo sviluppatosi dall'embrione ospite è noto con il nome di chimera e si origina dalle cellule embrionali di due topi diversi. Una parte dello sperma prodotto dalla chimera sarà transgenico e conterrà il DNA straniero, e quando gli spermatozoi feconderanno una normale cellula uovo, il topo che ha origine da essa sarà interamente transgenico con DNA straniero in tutte le cellule.

Exempi di ceppi transgenici

I topi di grandi dimensioni vengono modificati con un gene dell'ormone della crescita del ratto che li fa crescere più del normale, dopo di che vengono impiegati per lo studio della crescita e dello sviluppo.

• Negli oncotopi viene inattivato un oncogene predisponendoli a sviluppare il cancro. Questi topi sono stati di vitale importanza per la comprensione di molti tumori e lo sviluppo di tecnologie per il loro trattamento.
•    I topi Doogie presentano una migliorata memoria e capacità di apprendimento. Essi risultano avere una funzionalità potenziata dei recettori NMDA, le molecole proteiche di cui ha bisogno il cervello per immagazzinare informazioni nuove.

Topi knock-out

Lo sviluppo più recente di ceppi di topo knockout (con un gene soppresso) o (ceppi knock in, ovvero con un gene inserito) durante gli anni '80 ha segnato un grande passo in avanti per la genetica. Questa tecnologia permette di alterare dei geni particolari sul filamento del DNA, che di solito sono rimossi, ma possono essere anche inattivati o inseriti. Questo permette ai ricercatori di determinare la funzione esatta di un particolare gene e questi topi geneticamente modificati (GM) sono stati dei modelli eccellenti di molte malattie umane che non era stato possibile studiare negli animali fino ad allora. Il sequenziamento e l'analisi del genoma del topo ha permesso di individuare come bersagli molti geni e sottoporli allo studio mediante questa tecnologia. I creatori di questi primi topi knockout hanno ricevuto il Premio Nobel 2007 per la medicina.

Il retroterra del processo di indivuazione dei geni bersaglio

La tecnica che ha condotto alla creazione di topi knockout fu sviluppata da Joshua Lederburg, che ricevette il Premio Nobel per questa sua scoperta nel 1958. Egli scoprì che si potevano incrociare dei ceppi di batteri e procreare prole che mostrava l'unicità della propria genetica, come avviene nella riproduzione sessuale. Questo significò che quando furono impiegati i raggi X per provocare le mutazioni a livello delle strutture genetiche, fu possibile tramandare questi cambiamenti. Lederburg fu il primo a descrivere il processo di ricombinazione omologata nei batteri, nei quali le coppie di cromosomi si scambiano il materiale genetico, e scoprì che durante la ricombinazione, altri frammenti di materiale genetico presente nel corpo del batterio potevano essere integrati nella struttura genetica.

Due scienziati negli Stati Uniti, Mario Capecchi e Oliver Smithies cercavano di trovare dei modi di alterare sequenze specifiche del genoma dei mammiferi. Entrambi, ma separatamente, si resero conto che la tecnica di Lederburg si poteva usare per introdurre le mutazioni nei geni dei mammiferi. Nel frattempo, il lavoro di Martin Evans sulle cellule staminali embrionali fornì un mezzo di introdurre le mutazioni in un animale vivo alterando le cellule staminali, e quindi iniettandole in un ovulo di topo fecondato.

La creazione di topi knock-out

I topi knock-out e i topi knock-in sono creati secondo la tecnica gene-targeting, ovvero la sostituzione mirata di un frammento di DNA. Questa tecnica permette di alterare uno specifico gene nel genoma del topo, sostituendolo con una sequenza genetica simile che è stata modificata con una mutazione. La mutazione spesso impedisce al gene di funzionare. Quando vengono inoculati dei geni, spesso un gene del topo viene sostituito da un gene simile del genoma umano.

Il gene mutante si crea in un plasmide batterico che viene iniettato nelle cellule staminali embrionali del topo; generalmente esso proviene da un topo maschio. Le cellule provengono da un embrione di topo ai primissimi stadi e si divideranno per formare tutti i tipi di cellule del corpo. Lo scopo da raggiungere è che il materiale genetico mutante del plasmide formi del DNA nello sperma del topo quando esso è completamente cresciuto. Una volta che il plasmide è dentro una cellula staminale le due sequenze di DNA simili si scambiano materiale genetico mediante ricombinazione omologa, la quale scambia il nuovo gene mutante con il genoma del topo. Queste cellule quindi vengono impiantate in un embrione ospite per crescere. Vengono selezionati come ospiti i topi con il pelo di colore diverso, in modo che si distinguano i topi con i geni mutanti.

Il topo che nasce è una chimera, dato che solo alcune delle sue cellule verranno modificate. Questo topo avrà il pelo di due colori. Quando lo sperma del topo chimerico feconderà una cellula uovo normale nasceranno dei topi, alcuni dei quali avranno una copia singola del gene mutante. Questi topi avranno il pelo dello stesso colore del pelo del topo il cui DNA è stato originariamente alterato.

La produzione endogamica fra questi topi dà origine a una prole con due copie del gene mutante. Questi si dicono topi knockout.

Esempi di topi knockout

Esistono molti esempi di topi knockout, poichè questa tecnica è stata usata per studiare tutti gli aspetti fisiologici e per creare dei modelli di molte malattie umane.
•    Topi grassi, predisposti all'obesità a causa di una deficienza di carbossipeptidasi E
•    Topi forti, con un gene della miostatina disattivato.
•    Topi che tollerano il freddo, a loro manca un canale di sodio che causa dolore quando esposto al freddo.


References

  1. Mouse Genome Sequencing Consortium, Nature 420, 520-562 (2002)
  2. Home Office: Statistics of Scientific Procedures on Living Animals: Great Britain 2006. http://www.homeoffice.gov.uk/rds/pdfs07/spanimals06.pdf
  3. F. Alam et al. (2010) Bioluminescence imaging of a clinical isolate of Streptococcus pyogenes, Luminescence 25 ,2  179 -181

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